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May 27, 2023

Le virus du syndrome des points blancs (WSSV) module le métabolisme des lipides chez la crevette blanche

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 546 (2023) Citer cet article

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En plus de l'effet Warburg, qui augmente la disponibilité d'énergie et de blocs de construction biosynthétiques chez les crevettes infectées par le WSSV, le WSSV induit également à la fois la lipolyse au stade de la réplication du génome viral (12 hpi) pour fournir du matériel et de l'énergie pour la réplication du virus, et la lipogenèse au stade viral tardif (24 hpi) pour compléter la morphogenèse virale en apportant des espèces particulières d'acides gras à longue chaîne (LCFA). Ici, nous montrons en outre que le WSSV provoque une réduction des gouttelettes lipidiques (LD) dans les hémocytes au stade de la réplication du génome viral et une augmentation des LD dans les noyaux des hémocytes infectés par le WSSV au stade tardif viral. Dans l'hépatopancréas, la lipolyse est déclenchée par une infection par le WSSV, ce qui entraîne la libération d'acides gras dans l'hémolymphe. L'expérience d'inhibition de la β-oxydation révèle que les acides gras générés par la lipolyse induite par le WSSV peuvent être détournés vers la β-oxydation pour la production d'énergie. Au stade tardif viral, l'infection par le WSSV entraîne une lipogenèse dans l'estomac et l'hépatopancréas, ce qui suggère que les acides gras sont en forte demande à ce stade pour la morphogenèse du virion. Nos résultats démontrent que le WSSV module spécifiquement le métabolisme des lipides à différents stades pour faciliter sa réplication.

En induisant une reprogrammation métabolique, les cellules cancéreuses sont capables de répondre à leur demande en intermédiaires métaboliques et en énergie1,2,3. Par la suite, pour faciliter la croissance et la prolifération rapides des cellules cancéreuses, des biomolécules telles que des acides nucléiques, des protéines et des lipides sont générées4. Une partie importante de cette reprogrammation métabolique est le métabolisme lipidique altéré observé dans de nombreux types de cellules cancéreuses différentes5,6. Les lipides sont polyvalents et, dans les cellules cancéreuses, ils peuvent jouer plusieurs rôles. Ainsi, par exemple, les acides gras (AG) des cellules cancéreuses peuvent être utilisés pour construire une membrane biologique au cours de la prolifération des cellules cancéreuses7,8. Les enzymes impliquées dans l'oxydation des acides gras (FAO) sont également souvent surexprimées dans les cellules cancéreuses pour permettre la production d'énergie et de NADPH9,10. La modification des protéines par des fractions lipidiques est également associée au métabolisme du cancer11,12.

Comme les lipides sont fortement impliqués dans de nombreux processus biologiques dans une cellule cancéreuse, ils participent également aux divers mécanismes de réplication virale, allant de l'entrée à la libération13,14. Une reprogrammation métabolique des lipides a été retrouvée dans plusieurs virus déclenchant l'effet Warburg : l'herpèsvirus du sarcome de Kaposi (KSHV)15, le virus de l'hépatite C (VHC)16 et le papillomavirus humain (HPV)17. En modifiant le profil lipidique de l'hôte, le virus de la dengue (DENV) induit une altération membranaire, favorisant ainsi la réplication virale et protégeant le virus des mécanismes de défense antiviraux18. Le DENV utilise également la protéine de gouttelettes lipidiques AUP1 pour initier la lipophagie, qui à son tour génère des phospholipides pour faciliter la réplication du virus19. Une protéine du tégument du KSHV cible les radeaux lipidiques de la membrane de la cellule hôte pour faciliter la libération de particules virales20, tandis qu'une protéine du VHC appelée NS5A contribue à l'augmentation de la taille des gouttelettes lipidiques et favorise le processus de morphogenèse du VHC21. Pendant ce temps, dans les virus enveloppés, il est courant que les lipides de la membrane de la cellule hôte soient adaptés pour être utilisés comme enveloppe externe du virus22. Tous ces exemples démontrent comment la modification ou l'altération du métabolisme des lipides par un virus est nécessaire pour faciliter la production des particules de virion infectieuses.

Comme d'autres virus, il a été démontré qu'un virus mortel de la crevette appelé virus du syndrome des points blancs (WSSV) modifie la population et la composition de diverses espèces d'acides gras au cours de l'infection : au stade de la réplication du génome viral (12 hpi), le WSSV induit une lipolyse, dans lequel les acides gras subissent une β-oxydation pour générer de l'énergie et des biomolécules, tandis qu'au stade tardif (24 hpi), WSSV améliore l'expression de la synthase d'acide gras (FAS) pour soutenir la lipogenèse, entraînant la production de grandes quantités d'acide gras pour la morphogenèse du virion23. Dans la présente étude, nous étudions plus en détail les mécanismes à l'origine de ces modifications du métabolisme des lipides chez les crevettes infectées par le WSSV. Nous utilisons d'abord la coloration fluorescente pour étudier la localisation des gouttelettes lipidiques dans les hémocytes infectés à différents stades de la réplication du virus. Ensuite, nous mesurons l'activité de la lipase, une enzyme clé de la lipolyse, et surveillons son effet sur la quantité d'acides gras dans le tissu de crevette. Pour étudier comment la β-oxydation affecte la production d'énergie et la morphogenèse du virion, nous avons ensuite utilisé Etomoxir, un inhibiteur de CPT1, pour bloquer la β-oxydation chez les crevettes infectées par le WSSV. Enfin, nous bloquons à la fois la β-oxydation et la synthèse des acides gras dans les crevettes infectées et observons comment cela affecte les espèces d'acides gras à longue chaîne (LCFA) dans les tissus des crevettes.

Nous avons précédemment montré que le WSSV modifie la variété des acides gras à longue chaîne au cours de l'infection23. Ici, afin de mieux comprendre la dynamique de l'accumulation de lipides dans les crevettes infectées par le WSSV, nous avons utilisé la coloration BODIPY 493/503 pour surveiller les changements dans le nombre de gouttelettes lipidiques, leur distribution cellulaire et la taille des gouttelettes à 12 et 24 hpi (Fig. .1a). Au stade de la réplication du génome viral (12 hpi), moins de cellules du groupe infecté par le WSSV contenaient des gouttelettes lipidiques (LD) par rapport aux témoins PBS (Fig. 1bi), ce qui suggère la survenue d'une lipolyse à ce stade. Inversement, au stade viral tardif (24 hpi), le nombre d'hémocytes hébergeant des LD était significativement augmenté dans le groupe d'infection par WSSV, et chaque hémocyte avec des LD contenait également plus de LD puncta (Fig. 1bi, ii). Le WSSV n'a pas affecté le nombre d'hémocytes contenant des LD cytoplasmiques à aucun stade (Fig. 1biii), mais au stade tardif, les crevettes infectées par le WSSV avaient plus d'hémocytes avec des LD dans le noyau (Fig. 1biv). Le WSSV a également augmenté le nombre de LD cytoplasmiques et nucléaires au stade tardif (Fig. 1bv, vi). Le nombre accru de LD dans les hémocytes du groupe infecté par le WSSV a suggéré que le WSSV pourrait déclencher la lipogenèse à un stade avancé.

a Les hémocytes prélevés sur des crevettes infectées par le WSSV et des crevettes injectées au PBS (contrôle) à 12 hpi et 24 hpi ont été colorés avec du DAPI, du bleu d'Evan et du BODIPY pour visualiser le noyau, le cytoplasme et les gouttelettes lipidiques (LD), respectivement. La barre d'échelle représente 10 μm. b Divers paramètres ont été utilisés pour quantifier les LD : [i] Pourcentage de cellules avec des LD détectés ; [ii] Nombre de LDs puncta par cellule avec LDs ; [iii] Pourcentage de cellules avec des DL cytoplasmiques/cellules totales avec des DL ; [iv] Pourcentage de cellules avec des LD nucléaires/nombre total de cellules avec des LD ; Nombre de points lacrymaux LD présents dans [v] cytoplasme et [vi] noyau par hémocyte hébergeant LD ; Diamètre LD maximal dans [vii] cytoplasme et [viii] noyau ; Zone LD positive dans le cytoplasme [ix] et le noyau [x]. Les résultats ont été exprimés sous forme de moyenne (n> 3) de la proportion de cellules perméabilisées par rapport au nombre total de types de cellules de dénominateur spécifié (n> 100). Chaque barre représente la moyenne ± SD. Les astérisques indiquent les différences entre les groupes WSSV et PBS (*p < 0,05, **p < 0,01).

Dans le groupe WSSV, le diamètre et la section transversale totale des LD cytoplasmiques ont été significativement augmentés au stade de la réplication du génome viral et diminués au stade tardif viral (Fig. 1bvii, ix). Cependant, ces changements n'ont pas été observés dans les LD nucléaires (Fig. 1bviii, x).

Nous avons examiné l'activité de la lipase dans trois tissus différents de crevettes infectées par le WSSV. Au stade de la réplication du génome viral, aucune différence d'activité de la lipase n'a été observée entre les groupes PBS et WSSV dans les hémocytes ou l'estomac, mais l'activité de la lipase était élevée dans l'hépatopancréas infecté par le WSSV (Fig. 2a). Au stade tardif, l'activité de la lipase n'a pas été modifiée dans tous les tissus infectés par le WSSV (Fig. 2b). Les FFA, qui sont produits par l'activité de la lipase, ont également été détectés à des niveaux plus élevés dans les hémocytes et l'hémolymphe infectés par le WSSV au stade de la réplication du génome viral (Fig. 2c). Cela pourrait être dû à l'activité élevée de la lipase dans l'hépatopancréas. Inversement, les FFA étaient significativement diminués dans l'hépatopancréas infecté par le WSSV au stade tardif viral (Fig. 2c), ce qui pourrait être une conséquence de la déplétion lipidique au cours de la phase de réplication du génome viral.

Les tissus indiqués de crevettes injectées au PBS et au WSSV ont été collectés à 12 hpi et 24 hpi et soumis à une mesure de l'activité de la lipase a, b et (c) à la quantification des acides gras libres. L'activité de la lipase a été augmentée dans l'hépatopancréas infecté à 12 hpi. Les acides gras libres ont augmenté dans les hémocytes et l'hémolymphe à 12 hpi, alors qu'une diminution significative des acides gras libres a été observée dans l'hépatopancréas infecté à 24 hpi. Chaque barre représente la moyenne ± SD, n = 2 ~ 3 échantillons de pool (3 crevettes par pool). Les astérisques indiquent les différences entre les groupes WSSV et PBS (*p < 0,05, **p < 0,01). Hémocytes Hcy, hémolymphe Hly, estomac Stm, hépatopancréas Hep.

Dans des circonstances normales, les gouttelettes lipidiques et les triglycérides sont les substrats de la lipase, et ils peuvent être dégradés en FFA qui sont ensuite transportés dans les mitochondries et utilisés pour produire de l'énergie par β-oxydation24,25. Ici, nous avons traité des crevettes avec Etomoxir, un inhibiteur spécifique de la carnitine palmitoyltransférase I (CPT1), pour bloquer l'entrée des LCFA dans les mitochondries, inhibant ainsi la β-oxydation. Lorsque la β-oxydation était inhibée, nous avons constaté que l'activité mitochondriale (représentée par le rapport ATP / ADP) dans les hémocytes infectés par le WSSV était significativement réduite au stade de la réplication du génome viral mais augmentait au stade tardif (Fig. 3a). Pour déterminer si la β-oxydation est également importante pour la production de virions, nous avons ensuite mesuré le nombre de copies du génome viral dans les hémocytes et l'hémolymphe. Dans les hémocytes, le nombre de copies du génome viral dans le groupe solvant a augmenté au stade tardif viral par rapport au stade de réplication du génome viral, tandis que l'inhibition de la β-oxydation a conduit à un nombre de copies du génome viral encore plus élevé au stade tardif (Fig. 3b). De même, dans l'hémolymphe, l'inhibition de la β-oxydation a entraîné une augmentation significative du nombre de copies du génome viral au stade tardif (Fig. S1). Ces résultats montrent que l'inhibition de la β-oxydation conduit systématiquement à une augmentation des ADN génomiques viraux dans les hémocytes et l'hémolymphe, et suggèrent que la β-oxydation peut être impliquée dans la réplication du WSSV.

Les crevettes ont reçu une injection d'Etomoxir 10 h après la provocation au WSSV. a Les hémocytes de 12 hpi et 24 hpi ont été soumis à un dosage du rapport ATP/ADP. Les astérisques indiquent les différences entre les groupes WSSV et PBS (*p < 0,05, **p < 0,01). b Les hémocytes des deux moments après la provocation par le WSSV ont été utilisés pour quantifier le nombre de copies du génome viral afin d'évaluer la réplication de l'ADN viral. Chaque barre représente la moyenne ± SD, n = 3 à 4 échantillons de pool (4 crevettes par pool). Les astérisques indiquent les différences entre les groupes WSSV (*p < 0,05, **p < 0,01). Solv. solvant, Eto etomoxir, hémocytes Hcy.

La lipase a été activée dans l'hépatopancréas au stade de la réplication du génome viral (Fig. 2a) et nous avons émis l'hypothèse que les LCFA produits par l'activité de la lipase pourraient être déplacés vers la β-oxydation. Cela serait également cohérent avec Hsieh et al.23, qui ont rapporté que divers LCFA étaient diminués dans l'estomac infecté au même stade. Nous avons donc procédé à quantifier la quantité de divers LCFA dans l'hépatopancréas dans des conditions d'inhibition de la β-oxydation. Au stade de la réplication du génome viral, l'acide palmitique (C16:0), l'un des acides gras saturés les plus courants trouvés chez les animaux, a été significativement diminué par l'infection par le WSSV (groupe WSSV/PBS) par rapport au témoin PBS (groupe PBS/PBS) , mais augmentait significativement lorsque la β-oxydation était bloquée (groupe WSSV / Eto) (Fig. 4a). Des résultats similaires ont également été observés dans d'autres LCFA tels que C18: 0, C20: 1 et C20: 2 (Fig. 4a), suggérant que, comme prévu, le blocage de la β-oxydation empêchait la poursuite du traitement métabolique des LCFA induits par le WSSV. Au stade viral tardif, lorsque la lipolyse n'était plus activée (Hsieh et al.23), l'inhibition de la β-oxydation n'avait pas d'effet significatif (Fig. 4b). Ceci est cohérent avec l'idée que l'énergie produite par la β-oxydation n'est pas nécessaire à ce stade (Fig. 3a).

Des échantillons d'hépatopancréas ont été prélevés dans les groupes infectés par WSSV et les groupes témoins PBS à 12 et 24 hpi. Les groupes infectés par le WSSV ont été désignés par WSSV/PBS et WSSV/Eto selon que les crevettes infectées par le WSSV ont été traitées avec du PBS ou de l'Etomoxir. De même, les groupes témoins PBS ont été nommés PBS/PBS et PBS/Eto. Les profils LCFA de a 12 et b 24 hpi ont été déterminés par spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC/MS). L'inhibition de la β-oxydation a perturbé la consommation de LCFA induite par le WSSV à 12 hpi. Chaque barre représente la moyenne ± SD, n = 2 échantillons de pool (3 crevettes par pool). Les astérisques indiquent les différences entre les groupes WSSV et PBS (*p < 0,05, **p < 0,01).

Hsieh et al.23 ont démontré l'implication du FAS dans la réplication du WSSV : 1. L'expression du FAS a été induite par le WSSV via la voie de signalisation PI3K-Akt-mTOR-HIF1α ; 2. Le FAS était crucial pour la morphogenèse du virion. Pour caractériser le rôle du FAS dans la génération de LCFA, 4 h après l'injection de WSSV, les crevettes infectées par le virus ont été injectées par voie intramusculaire avec l'inhibiteur de FAS C75, et les LCFA ont ensuite été quantifiés dans l'estomac et l'hépatopancréas. Dans l'estomac au stade de la réplication du génome viral, divers LCFA ont été diminués par l'infection par le WSSV (groupe WSSV/PBS) ; cependant, à l'exception de quelques LCFA, lorsque le SAF était également inhibé (groupe WSSV / C75), l'ampleur de ces diminutions était réduite (Fig. 5a). Au stade tardif, plusieurs LCFA, dont C16:0, C18:1n-9c, C18:1n-9t et C20:5n-3, ont été augmentés par l'infection par WSSV (groupe WSSV/PBS), suggérant que la lipogenèse a été induite ( figure 5b). Cependant, l'inhibition du FAS a perturbé la génération de LCFA chez les crevettes infectées par le WSSV (groupe WSSV / C75) (Fig. 5b).

C75 a été injecté dans la crevette 4 h après l'injection de WSSV pour inhiber le FAS. Les groupes infectés par le WSSV ont été désignés par WSSV/PBS et WSSV/C75 pour indiquer que les crevettes infectées par le WSSV ont été injectées avec du PBS ou du C75. Les groupes témoins PBS ont été nommés PBS/PBS et PBS/C75. La spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC/MS) a été utilisée pour étudier le profil des LCFA dans l'estomac infecté par le WSSV à 12 hpi et b 24 hpi. L'inhibition du FAS a réduit la production des LCFA au stade tardif de l'infection. Chaque barre représente la moyenne ± SD, n = 2 à 4 échantillons de pool (3 crevettes par pool). Les astérisques indiquent les différences entre les groupes WSSV et PBS (*p < 0,05, **p < 0,01).

Comme le montre la figure 6a, le WSSV a également réduit l'acide palmitique et l'acide stéarique (C18: 0) dans les hépatopancréas infectés au stade de la réplication du génome viral (groupe WSSV / PBS), mais cette réduction a été annulée par l'inhibition du FAS (groupe WSSV / C75 ). Au stade tardif, divers LCFA ont été augmentés dans l'hépatopancréas infecté (groupe WSSV / PBS), tandis que l'inhibition du FAS n'a eu aucun effet significatif (groupe WSSV / C75) (Fig. 6b). Ces résultats sont cohérents avec le rapport de Hsieh et al.23, dans lequel la lipolyse a été déclenchée au stade de la réplication du génome viral et la lipogenèse au stade tardif, et collectivement, ils confirment que le WSSV redirige le métabolisme des lipides chez les crevettes infectées par le WSSV.

La spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC/MS) a été utilisée pour étudier l'hépatopancréas infecté par le WSSV inhibé par le FAS à a 12 et b 24 hpi. Les groupes infectés par le WSSV ont été désignés par WSSV/PBS et WSSV/C75 pour indiquer que les crevettes infectées par le WSSV ont été injectées avec du PBS ou du C75. Les groupes témoins PBS ont été nommés PBS/PBS et PBS/C75. Contrairement à l'estomac (Fig. 5b), l'inhibition du FAS n'a eu aucun effet sur la production de LCFA dans l'hépatopancréas au stade tardif. Chaque barre représente la moyenne ± SD, n = 2 à 4 échantillons de pool (3 crevettes par pool). Les astérisques indiquent les différences entre les groupes WSSV et PBS (*p < 0,05, **p < 0,01).

La reprogrammation métabolique des lipides se retrouve non seulement dans les cellules cancéreuses et les cellules infectées par des virus de vertébrés26,27,28, mais également dans les cellules d'invertébrés infectées par des virus18. Nos résultats actuels, qui incluent de nouvelles données sur les acides gras non liés, fournissent maintenant plus de détails sur la façon dont le métabolisme des lipides dans les crevettes infectées par le WSSV est réacheminé. Une étude précédente23, qui a trouvé que la lipolyse est induite au stade de la réplication du génome viral alors que la lipogenèse est induite au stade tardif de la réplication du virus, a également rapporté que ces changements métaboliques sont caractérisés par des changements dans les profils des LCFA, plusieurs LCFA étant diminués. au stade de la réplication du génome viral. Nos résultats actuels de coloration LD montrent en outre qu'il existe une réduction des LD, en particulier des LD cytoplasmiques, au stade de la réplication du génome viral (Fig. 1bi, v), fournissant ainsi une preuve supplémentaire que la lipolyse se produit à ce stade. Les FFA libérés par ce processus servent alors de source de production d'énergie via la β-oxydation (Fig. 3a). Les acides gras sont utilisés de manière similaire dans une lignée cellulaire humaine infectée par le virus de la dengue (DENV), où les LD sont transportés vers les lysosomes et les acides gras libérés subissent ensuite une β-oxydation pour générer de l'ATP pour la réplication du virus29. En ce qui concerne le lien entre la β-oxydation et la morphogenèse du virion (Figs. 3b et S1), nous émettons l'hypothèse que la consommation d'acides gras via la β-oxydation génère également le matériel nécessaire à la lipogenèse et à la morphogenèse du virion qui se produit au stade tardif de la maladie virale. réplication. À l'appui de cela, nous notons que le nombre d'espèces d'hydrocarbures et de cholestérol est plus élevé dans le virion WSSV par rapport aux noyaux de la cellule hôte30, et que l'entérovirus redistribue les acides gras de l'hôte dans ses compartiments de réplication via la lipolyse31, les deux observations étant cohérentes avec l'idée que l'acide gras consommé pourrait être réutilisé pour la production de lipides spécifiques tels que le cholestérol. Cependant, nous notons également que l'inhibition de la β-oxydation a entraîné une augmentation de l'ADN viral à la fois à l'intérieur des hémocytes (Fig. 3b) et dans l'hémolymphe (Fig. S1), ce qui est difficile à expliquer si la β-oxydation est réellement à l'origine de la morphogenèse du virion. . D'autre part, étant donné que notre méthode de comptage du nombre de copies de virions détecterait aussi bien les virions complets qu'incomplets, il est également possible que l'inhibition de la β-oxydation perturbe le processus de morphogenèse du virion d'une manière qui provoque de grandes quantités de virions anormaux. et/ou de l'ADN viral nu à libérer dans l'hémolymphe. De toute évidence, ces possibilités devront être davantage explorées expérimentalement à l'aide d'une technique telle que le traçage isotopique.

L'accumulation de LD, qui est observée dans les cellules infectées par le VHC et le SRAS-CoV-232,33, a également été observée dans les hémocytes infectés par le WSSV au stade tardif de l'infection virale (Fig. 1bi, ii) ainsi que rapportée par Hsieh et al.23. Ici, la plupart des DL étaient localisées dans les noyaux des hémocytes infectés (Fig. 1biv, vi), où se produit la morphogenèse du virion34,35. L'imagerie Raman a également montré que la teneur en lipides était sensiblement augmentée dans le noyau des hémocytes infectés [à 60 hpi] (Fig. S2). À ce jour, on ne sait toujours pas comment le WSSV pourrait tirer parti des DL accumulées localisées dans le noyau des hémocytes, mais nous supposons qu'ils pourraient fournir une réserve de composants viraux à utiliser pour la morphogenèse du virion, comme ils le font pour le virus de l'hépatite C, où le noyau de la nucléocapside du VHC et la protéine régulatrice NS5A effectuent une translocation du réticulum endoplasmique (ER) vers les LD, qui agissent alors comme un site d'assemblage du virion36. De plus, les DL nucléaires accumulées dans les cellules de vertébrés peuvent être impliquées dans la régulation de l'expression génique qui facilite la morphogenèse virale au stade tardif viral37. Les LD pourraient ainsi avoir deux destins au cours d'une infection à WSSV : 1. au stade de la réplication du génome viral, les LD sont décomposées pour produire de l'énergie et, éventuellement, fournir du matériel pour la morphogenèse du virion ; 2. au stade tardif viral, les LD s'accumulent dans le noyau pour soutenir la morphogenèse du virion.

En tant que parasite obligatoire, les virus tirent leur énergie (sous forme d'ATP) des hôtes cellulaires pour leur réplication38. Les résultats du rapport ATP / ADP illustrés à la Fig. 3a montrent que le WSSV a élevé l'ATP dans le groupe solvant aux deux étapes (contrôle PBS vs WSSV à 12 et 24 hpi). Des résultats similaires ont été rapportés par Apún-Molina et al.39, où une charge d'énergie adénylique (AEC) plus élevée a été observée dans l'hépatopancréas infecté par le WSSV à 24 hpi. Cette élévation de l'ATP est cohérente avec des recherches antérieures, qui ont révélé que le WSSV nécessite de l'énergie pour faciliter sa réplication39,40,41. Comme discuté précédemment, la β-oxydation pourrait fournir de l'ATP pour la réplication du virus au stade de la réplication du génome viral. Étonnamment cependant, à 24 hpi, l'inhibition de la β-oxydation a entraîné des niveaux élevés d'ATP quel que soit le statut de l'infection (Fig. 3a, groupe solvant vs groupe étomoxir à 24 hpi). Nous supposons que la longue durée de l'inhibition de la β-oxydation pourrait avoir conduit à l'activation d'autres voies énergétiques afin de maintenir la viabilité cellulaire.

La figure 2a montre que l'activité de la lipase a été déclenchée dans l'hépatopancréas de crevette, qui est un tissu stockant les lipides. Contrairement aux acides gras totaux, dont Hsieh et al.23 ont constaté une diminution dans l'estomac à 12 hpi et une augmentation à 24 hpi, ce que nous avons trouvé ici suggère qu'à 12 hpi, les AGL pourraient avoir été libérés de l'hépatopancréas dans l'hémolymphe et puis repris par les hémocytes (Fig. 2c). Nous notons que l'absorption des FA est également favorisée par d'autres virus à des fins de réplication42,43,44. Par la suite, la réduction substantielle des AGL dans l'hépatopancréas au stade tardif viral (Fig. 2c) suggère que l'hépatopancréas peut agir comme une source d'AF au cours de l'infection virale. Nous avons en outre observé que plusieurs LCFA étaient diminués dans l'hépatopancréas infecté par le WSSV au stade de la réplication du génome viral (Fig. 4a), mais que lorsque la β-oxydation était inhibée, cette consommation de LCFA induite par le WSSV n'était plus observée (Fig. 4a). Ces résultats suggèrent que les lipides stockés dans l'hépatopancréas sont décomposés par lipolyse au stade de la réplication du génome viral, et que les acides gras produits par ce processus sont ensuite soit soumis à une β-oxydation, soit libérés directement dans l'hémolymphe pour alimenter le virus infecté par le WSSV. hémocytes. Inversement, au stade tardif viral, l'inhibition de la β-oxydation n'a fait aucune différence significative dans la disponibilité des LCFA (Fig. 4b), ce qui suggère qu'à ce stade, comme proposé par Hsieh et al.23, la reprogrammation lipidique induite par le WSSV déplacé de la lipolyse vers la lipogenèse.

Le FAS, une enzyme majeure dans la lipogenèse, est activé dans les cellules tumorales pour soutenir la prolifération et dans les cellules infectées par le virus pour la morphogenèse du virion45,46,47. Nous avons précédemment découvert que l'inhibition du FAS altère la morphogenèse du virion mais pas l'expression de la protéine virale23. Ici, nous avons en outre constaté que l'état énergétique des hémocytes infectés par le WSSV n'était pas perturbé par l'inhibition du FAS (Fig. S3). Tous ces résultats impliquent que le FAS produit du FA uniquement pour être utilisé dans la morphogenèse du virus. Comme prévu, au stade tardif viral, l'inhibition du FAS a entravé la lipogenèse induite par le WSSV dans l'estomac infecté (Fig. 5b); cependant, cet effet n'a pas été observé dans l'hépatopancréas, à l'exception de l'acide oléique (C18: 1n-9c) (Fig. 6b). De manière surprenante, l'inhibition du FAS a également retardé la consommation de certains des LCFA dans l'estomac et l'hépatopancréas infectés par le WSSV (figures 5a et 6a).

Pris ensemble, ces résultats montrent comment le WSSV est capable de moduler le métabolisme des lipides de l'hôte pour établir un environnement favorable à sa réplication : le WSSV déclenche soit une lipolyse soit une lipogenèse selon que le virus utilise les AG comme source d'énergie ou comme matériau pour la morphogenèse virale. Il s'agit du même type de reprogrammation lipidique que celle observée avec certains Flavivirus48,49,50. Afin de développer une stratégie antivirale efficace, il sera important d'élucider davantage les voies de signalisation et les protéines virales qui soutiennent ces mécanismes. Bien que nous ayons précédemment montré que le WSSV induit l'expression du FAS via la voie PI3K-Akt-mTOR-HIF1α23, d'autres voies de signalisation pourraient également être impliquées. Il sera également intéressant d'étudier comment le WSSV est capable de réguler le passage de la lipolyse à la lipogenèse à un moment précis après l'infection.

Les crevettes blanches (Litopenaeus vannamei; 3 g de poids corporel) utilisées dans cette étude ont été obtenues auprès du Centre des animaux aquatiques de l'Université nationale de l'océan de Taiwan, du Centre international pour le développement scientifique de l'aquaculture de crevettes, de l'Université nationale Cheng Kung (NCKU) et du Département de l'aquaculture, Université nationale des sciences et technologies de Pingtung (NPUST). Les crevettes ont été cultivées dans des systèmes de réservoirs contenant de l'eau de mer stérilisée (30 ppt; 25–27 ° C) pendant 1 à 2 jours avant les expériences. Le stock de virus pour l'inoculum expérimental a été obtenu en collectant l'hémolymphe de crevettes SPF (spécifiques exemptes d'agents pathogènes) moribondes infectées par l'isolat WSSV Taiwan (n° d'accès GenBank AF440570) puis en diluant avec une solution saline tampon phosphate (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 KCl mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM). Le stock de virus a été stocké à -80 ° C et l'inoculum expérimental a été préparé à partir du stock par dilution (10–4) avec du PBS. Les crevettes ont été provoquées par injection intramusculaire avec l'inoculum WSSV (100 ul/crevette). Ce titre de provocation a entraîné une mortalité cumulée induite par le WSSV de 50 % à 72 hpi.

12 et 24 h après l'injection du virus, l'hémolymphe de 3 ~ 6 crevettes du groupe injecté par WSSV et injecté par PBS a été collectée individuellement avec un volume égal de solution anticoagulante (450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM EDTA, 10 Tris-HCl mM, pH 7,5). Chaque échantillon d'hémocytes a ensuite été ensemencé sur une lamelle couvre-objet en double avec 2 × milieu de Leibovitz 15 (Invitrogen ; avec 10 % de FBS, 1 % de glucose, 0,005 % de NaCl, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine, 1,25 g/ ml de fongizone). Après incubation pendant 20 min à température ambiante, les hémocytes ont été lavés trois fois avec du PBS puis incubés avec BODIPY 493/503 (Invitrogen) à une concentration de travail de 0,1 mg/mL pendant 1 h dans l'obscurité à température ambiante pour colorer le neutre gouttelettes lipidiques. Les hémocytes ont ensuite été lavés 3 fois de plus avec du PBS avant d'être fixés avec du formaldéhyde à 4% sur de la glace. Ensuite, les cellules ont été colorées pendant 3 min avec du DAPI à une concentration de travail de 1, 5 × 10-5 µg / ml (dichlorhydrate de 4′-6-diamidino-2-phénylindole; Vector Laboratories Inc.) pour contre-colorer les noyaux. Après 3 autres lavages avec du PBS, les hémocytes ont été incubés avec du bleu d'Evans (0,2 μg/ml) pendant 1 minute pour contre-colorer le cytoplasme. Enfin, les cellules sur les couvre-objets ont été montées sur des lames de microscope et la fluorescence a été étudiée à l'aide d'un microscope à fluorescence.

Après que les LD dans les hémocytes de crevettes primaires infectés par le WSSV ont été colorés comme décrit ci-dessus, plusieurs champs ont été sélectionnés au hasard dans chaque diapositive pour la capture d'image et l'analyse ultérieure. Pour chaque crevette, au moins 100 cellules ont été étudiées. Plusieurs mesures ont été utilisées dans cette étude pour évaluer la dynamique des gouttelettes lipidiques dans les hémocytes de crevettes : (i) Cellules avec DL/cellules totales (%) ; (ii) nombre de LD puncta dans les cellules avec LDs ; (iii) cellules avec LD cytoplasmiques/cellules totales avec LD (%); (iv) cellules avec des DL nucléaires/cellules totales avec des LD (%); (v) nombre de points ponctuels LD cytoplasmiques par cellule avec LD; (vi) nombre de points lacrymaux LD nucléaires par cellule avec LDs; (vii) diamètre maximal des DL cytoplasmiques ; (viii) diamètre maximum des DL nucléaires ; (ix) surface totale de la section transversale (µm2) des DL dans le cytoplasme ; (x) surface totale de la section transversale (µm2) des DL dans le noyau. Les données ont ensuite été soumises à l'analyse statistique décrite ci-dessous.

Des échantillons regroupés d'hémocytes de crevettes, d'estomac et d'hépatopancréas ont été prélevés 12 et 24 h après l'injection de WSSV (3 crevettes/pool et 4 pools/groupe) et l'activité de la lipase a été mesurée à l'aide d'un kit commercial (Lipase Activity Fluorometric Assay Kit III ; BioVision Inc. .). Les échantillons ont été homogénéisés dans 100 µl (hémocytes) ou 200 µl (estomac et hépatopancréas) de tampon de test de lipase glacé et centrifugés pour éliminer les débris cellulaires. Les lysats résultants (50 μl/puits) ont été transférés dans une plaque à 96 puits et 50 μl du mélange réactionnel (48 μl de tampon d'essai et 2 μl de substrat Lipase) ont été ajoutés dans chaque puits. Après incubation à 37 °C pendant 30 min (T1), l'absorbance de chaque échantillon a été mesurée à Ex/Em = 529/600 nm pour obtenir la valeur A1. Après incubation pendant 30 min supplémentaires (T2), l'absorbance de chaque échantillon a été mesurée à nouveau pour obtenir la valeur A2. Une courbe standard de méthylrésorufine a été générée à partir d'une série de concentrations allant de 0 à 100 pmol/puits et utilisée pour convertir la différence d'absorbance (A2-A1) en la quantité correspondante de méthylrésorufine (la valeur B). L'activité lipase a été calculée comme suit : Activité lipase (mU/mg) = ΔB/ (ΔT × mg), où mg est le poids de l'échantillon de tissu dans chaque mélange réactionnel. Les données résultantes ont ensuite été soumises à l'analyse statistique comme décrit ci-dessous.

Un kit colorimétrique/fluorométrique de quantification des acides gras libres (BioVision Inc.) a été utilisé pour détecter les acides gras à longue chaîne non liés dans chaque échantillon de crevette. Pour les échantillons d'hémocytes et d'hémolymphes, l'hémolymphe de crevette a été collectée et les hémocytes ont été séparés par centrifugation. Des échantillons d'hémocytes, d'hémolymphes, d'estomac et d'hépatopancréas ont été homogénéisés avec 200 μl de chloroforme-Triton X-100 (1% de Triton X-100 dans du chloroforme pur), et après centrifugation (10 min à 13 000 × g), la phase organique (phase inférieure) de chaque échantillon a été recueilli, séché à l'air à 50 ° C jusqu'à ce qu'il ne reste plus de solution, puis séché sous vide pendant 30 min. Ensuite, le culot (les lipides séchés) de chaque échantillon a été dissous dans 200 μl de tampon de dosage d'acide gras et 50 μl de la solution résultante ont été transférés dans un puits sur une plaque à 96 puits. Le réactif ACS (2 μl) a été ajouté et le mélange a été incubé à 37 ° C pendant 30 min. Enfin, 50 μl de mélange réactionnel (44 μl de tampon de dosage d'acide gras, 2 μl de sonde d'acide gras, 2 μl de mélange d'enzymes et 2 μl d'activateur) ont été ajoutés au puits et le mélange a été incubé dans l'obscurité pendant 30 minutes supplémentaires à 37 °C. Pour l'étalonnage, des échantillons d'acide palmitique et des blancs ont été utilisés conformément aux instructions du fabricant. L'absorbance de chaque échantillon a été mesurée à Ex/Em = 535/590 nm, et une courbe standard d'acide palmitique a été générée à partir d'une série de concentrations allant de 0 à 10 nmol. Cela a été utilisé pour convertir les lectures d'échantillons en la quantité correspondante de FFA (Fa) dans chaque puits. La concentration en FFA a ensuite été calculée comme suit : Concentration en acides gras (nmol/mg) = Fa/Smg où Smg est le poids de tissu de l'échantillon dans chaque mélange réactionnel. Les données résultantes ont été soumises à l'analyse statistique comme décrit ci-dessous.

Solutions mères d'inhibiteur de CPT1 Étomoxir (2[6(4-chlorophénoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate ; Tocris Bioscience) et d'inhibiteur de FAS C75 (acide 4-méthylène-2-octyl-5-oxotétrahydrofuran-3-carboxylique ; ENZO Life Sciences) ont été préparés par dissolution dans ddH2O et DMSO respectivement. Avant utilisation, les deux stocks ont été dilués avec du PBS à la concentration requise.

Un kit d'analyse du rapport ADP/ATP ApoSENSOR (BioVision) a été utilisé pour déterminer le rapport ATP/ADP dans des pools d'hémocytes (4 à 5 pools ; 4 crevettes par pool) collectés à 12 et 24 hpi. La procédure a été légèrement modifiée par Li et al.40 et Chen et al.41. Une fois l'hémolymphe prélevée sur les crevettes provoquées, elle a été regroupée et centrifugée à 3000 × g pendant 10 min à 4 ° C, et le culot d'hémocytes résultant a été mis en suspension dans 50 μl de tampon libérant des nucléotides. Cette suspension a ensuite été ajoutée à des puits contenant 10 ul d'enzyme de surveillance ATP et 90 ul de tampon de libération de nucléotides sur une plaque ELISA à 96 puits. Le contrôle de luminescence de fond a été préparé avec uniquement l'enzyme de surveillance de l'ATP et le tampon de libération des nucléotides. Pour mesurer le niveau d'ATP dans les hémocytes, la première mesure a été effectuée pour le contrôle (Données A) et l'échantillon (Données B) après 2 min d'incubation. Pour mesurer le niveau d'ADP dans les hémocytes, une deuxième mesure a été effectuée à nouveau pour l'échantillon (Données C). L'enzyme de conversion ADP (1 ul) a ensuite été ajoutée à l'échantillon et une mesure finale (données D) a été prise. Toutes les mesures ont été faites à l'aide d'un luminomètre. Le ratio ATP/ADP a été calculé comme suit : (Données B) - (Données A)/[(Données D - Données A) - (Données C - Données A)].

Pour étudier la libération du virion, les hémocytes ont été séparés de l'hémolymphe par centrifugation. L'ADN génomique total a été extrait à la fois des hémocytes et de l'hémolymphe en utilisant un kit d'extraction d'ADN DTAB/CTAB (GeneReach Biotechnology Corp.). Les nombres de copies du génome WSSV ont été quantifiés par un système quantitatif IQ RealTM WSSV (GeneReach Biotechnology Corp.), une PCR commerciale en temps réel, conformément aux instructions du fabricant.

Pour examiner le rôle de la β-oxydation et des LCFA dans la réplication du WSSV, nous avons utilisé respectivement l'inhibiteur de CPT1 Etomoxir et l'inhibiteur de FAS C75. Pour l'inhibition de CPT1, les crevettes ont reçu une injection intramusculaire d'Etomoxir (62,5 mg/g de crevettes) ou de véhicule PBS (témoin) 10 h après la provocation au WSSV. Des échantillons groupés d'hépatopancréas (4 à 5 échantillons groupés; 3 crevettes par pool) ont été prélevés à 12 et 24 hpi. Le profilage des acides gras basé sur GC/MS a été utilisé pour surveiller la dynamique de chaque acide gras à longue chaîne détecté. Pour l'inhibition du FAS, les dosages et le moment du traitement au C75 ont été modifiés par rapport à notre étude précédente. Les crevettes ont été traitées avec l'inhibiteur du FAS C75 (30 μg/g de crevettes) 4 h après avoir été injectées avec du WSSV ou du PBS. Des échantillons d'hépatopancréas et d'estomac (4 à 5 échantillons regroupés ; 3 crevettes par pool) ont été prélevés à 12 et 24 hpi et utilisés pour l'analyse GC/MS.

La lipodomie de crevettes basée sur la spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC/MS) a été réalisée sur la base des méthodes décrites par Hsieh et al.23. En bref, une solution de chloroforme contenant un contrôle interne d'acide gras C22: 0 a d'abord été ajoutée aux tissus de crevettes (10 à 30 mg par échantillon), et les acides gras ont ensuite été extraits des tissus par homogénéisation avec 2: 1 (v / v ) chloroforme/méthanol. Après agitation pendant une nuit et élimination des débris par filtration, la fraction liquide a été séchée à 40°C à l'aide d'un évaporateur rotatif. Les pastilles résultantes de chaque échantillon ont ensuite été redissoutes avec du chloroforme pur, transférées dans un flacon de réaction de 10 ml puis séchées à nouveau à l'aide de l'évaporateur rotatif. Les échantillons séchés ont été soumis à une saponification/estérification suivie d'une analyse lipodomique GC/MS à l'aide d'un appareil de chromatographie en phase gazeuse 7890A équipé d'un spectromètre de masse monoquadripôle 5975C (Agilent, Palo Alto, CA, USA) et d'une colonne capillaire Supelco SP-2380 ( 30 mx 0,25 mm id ; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) comme décrit précédemment23. MSD Chemstation G1701EA E.02.02.1431 (Agilent Technologies, Inc., USA) a été utilisé pour le contrôle de l'instrument, l'acquisition et l'analyse des données. La bibliothèque de spectres de masse NIST 11 (Gaithersburg, MD, États-Unis) a été utilisée pour faciliter l'identification des esters méthyliques FA (FAME), ainsi que les temps de rétention des étalons achetés auprès de Sigma-Aldrich. Les acides gras identifiés ont été quantifiés par rapport à l'étalon interne d'acides gras C22:0, et la quantité de FA par mg de tissu a été calculée. Les données résultantes ont été soumises à l'analyse statistique comme décrit ci-dessous.

Les calculs de données et les graphiques ont été effectués dans Microsoft Excel et Graphpad Prism 9 respectivement. Les données brutes ont été recueillies à partir d'au moins trois répétitions indépendantes dans chaque expérience, comme décrit en détail dans la section méthode correspondante. Après que la règle empirique a été appliquée comme décrit précédemment51 sur toutes les données pour la détection et l'exclusion des valeurs aberrantes statistiques, les différences statistiquement significatives entre les groupes ont été analysées soit par le test t de Student pour comparer plusieurs traitements. Les données fournies dans les données supplémentaires 1 sont utilisées pour générer les chiffres présentés dans cette étude. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. La signification est indiquée par *p < 0,05, **p < 0,01.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources pour les principaux chiffres présentés dans cette étude sont fournies en tant que données supplémentaires 1. Toutes les autres données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Cette recherche a été financée par le National Science and Technology Council, Taiwan (MOST 106-2321-B-006-010, MOST 108-2314-B-006-096-MY3, MOST 110-2634-F-006-019 et NSTC 111 -2628-B-006-017). Nous remercions également chaleureusement M. Paul Barlow, de l'Université nationale Cheng Kung, pour sa critique utile de ce manuscrit.

Département des sciences de la biotechnologie et de la bioindustrie, Collège des sciences biologiques et de la biotechnologie, Université nationale Cheng Kung, Tainan, Taïwan

Yen Siong Ng, Cheng-Shun Cheng, Yi-Ting Tseng, Shu-Ting He, Chun-Yuan Li, Shu-Wen Cheng, Yi-Min Chen, Ramya Kumar et Han-Ching Wang

Organisation de recherche pour les nanotechnologies et les innovations de la vie, Université Waseda, Tokyo, Japon

Masahiro Ando et Haruko Takeyama

Centre international pour le développement scientifique de l'aquaculture de crevettes, Université nationale Cheng Kung, Tainan, Taïwan

Ramya Kumar et Han-Ching Wang

Département d'aquaculture, Université nationale des sciences et technologies de Pingtung, Pingtung, Taïwan

Chun-Hung Liu

Département des sciences de la vie et des biosciences médicales, Université Waseda, Tokyo, Japon

Haruko Takeyama

Computational Bio Big-Data Open Innovation Laboratory (CBBD-OIL), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tokyo, Japon

Haruko Takeyama

Institut de recherche avancée sur la dynamique des biosystèmes, Waseda Research Institute for Science and Engineering, Tokyo, Japon

Haruko Takeyama

Département des biosciences marines, Université des sciences et technologies marines de Tokyo, Tokyo, Japon

Ikuo Hirono

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C.-SC, H.-CW, MA, Y.-MC et Y.-TT ont conçu l'étude. C.-SC, S.-TH, C.-YL et Y.-TT ont réalisé des expériences. C.-SC, S.-TH, C.-YL, YSN et. Y.-TT a analysé les données. C.-HL, H.-CW, HT, IH et Y.-MC ont fourni des ressources. C.-SC, RK, S.-WC et YSN ont rédigé l'article. C.-HL, HT, IH, H.-CW, MA et Y.-MC ont supervisé le projet.

Correspondance à Han-Ching Wang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Liu Haipeng, Claudio Mejía-Ruiz et Ilie Racotta pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef principaux : Gabriela da Silva Xavier, David Favero. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Ng, YS, Cheng, CS., Ando, ​​M. et al. Le virus du syndrome des points blancs (WSSV) module le métabolisme des lipides chez la crevette blanche. Commun Biol 6, 546 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04924-w

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Reçu : 26 septembre 2022

Accepté : 08 mai 2023

Publié: 20 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04924-w

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